Kinetics-based discrimination of reversibly photoswitchable fluorescent labels
Kinetics-based discrimination of reversibly photoswitchable fluorescent labels
Résumé
Multiplexing, i.e. simultaneously imaging tens of chemical species in a cell, is a challenge for quantitative biology. To this aim, two imaging protocols, LIGHTNING and HIGHLIGHT,
exploiting the kinetics of rich photocycles including photochemical and thermal steps are introduced
and applied to reversibly photoswitchable fluorescent proteins (RSFPs). In LIGHTNING, four characteristic times defining the kinetic signature of an RSFP are extracted from fluorescence evolution in
four constant illumination regimes granting access to four independent dynamics. Reduced chemical
mechanisms derived for the four illumination regimes qualitatively account for fluorescence evolution.
Two RSFPs can be distinguished provided that the distance between their 4-D kinetic signature is
larger than a cutoff distance related to experimental accuracy. 20 RSFPs out of the 22 investigated
RSFPs are discriminated. In HIGHLIGHT, reversibly photoactivatable fluorophores are submitted to
sine-wave illumination. At each harmonics, either the in-phase or the quadrature Fourier amplitude
of fluorescence oscillations exhibits a resonance in the space of control parameters formed by the excitation frequency and the mean light intensities. Resonance conditions relating the control parameters
and parameters characterizing kinetics are made explicit. Tuning the control parameters to target
a given fluorophore optimizes its fluorescence response and nearly eliminates the responses of fluorophores with different kinetic properties. Both protocols have complementary merits. LIGHTNING
has a larger discriminatory power and HIGHLIGHT provides better quality images due to lock-in
amplification.
Le multiplexage ou imagerie simultan´ee de dizaines d’esp`eces dans une cellule, est
un d´efi pour la biologie quantitative. Deux protocoles d’imagerie, LIGHTNING et HIGHLIGHT,
exploitant la cin´etique riche de photocycles comprenant des ´etapes photochimiques et thermiques, ont
´et´e con¸cus et appliqu´es `a des prot´eines fluorescentes r´eversiblement photocommutables (RSFP). Dans
LIGHTNING, 4 temps caract´eristiques d´efinissant la signature cin´etique d’une RSFP sont extraits de
l’´evolution de la fluorescence pour 4 conditions d’illumination constante donnant acc`es `a 4 dynamiques
ind´ependantes. Des m´ecanismes chimiques r´eduits sont d´eriv´es pour les 4 conditions d’illumination.
Deux RSFP sont distingu´ees si la distance entre leurs signatures cin´etiques est plus grande qu’une
distance de coupure li´ee `a la pr´ecision exp´erimentale. 20 RSFP parmi les 22 ´etudi´ees sont discrimin´ees.
Dans HIGHLIGHT, des fluorophores reversiblement photocommutables sont soumis `a un ´eclairement
sinuso¨ıdal. A chaque harmonique, l’amplitude de Fourier en phase ou en quadrature des oscillations de
fluorescence pr´esente une r´esonance dans l’espace des param`etres de contr^ole, fr´equence d’excitation
et intensit´es lumineuses moyennes. Des conditions de r´esonance reliant les param`etres de contr^ole
et les param`etres caract´erisant la cin´etique sont explicit´ees. Le choix des param`etres de contr^ole
permet d’optimiser la r´eponse d’un fluorophore tout en ´eliminant celle des fluorophores de cin´etiques
diff´erentes. Les deux protocoles ont des m´erites compl´ementaires. LIGHTNING a un pouvoir discriminant plus important et HIGHLIGHT fournit des images de meilleure qualit´e gr^ace `a une d´etection
synchrone