New dimensions for multiplexed fluorescence imaging
New dimensions for multiplexed fluorescence imaging
Résumé
Our research group had previously developed the OPIOM protocols for fluorescence imaging. By exploiting their cross sections
of fluorescence photoswiching, OPIOM can selectively extract the response of reversibly photoswitchable fluorophores (RSFs)
in the presence of spectrally interfering fluorophores. However, OPIOM allowed us to discriminate only 3 spectrally similar
reversibly photoswitchable fluorescent proteins (RSFPs). The goal of this PhD was to augment this number. To reach this goal,
a new automated instrumental setup called photoswichometer was first developed to express and screen the rich photochemical
signature of 22 RSFPs by analyzing their fluorescence response to light jumps with intensities covering 5 orders of magnitude.
This signature has been first exploited in a new fluorescence imaging protocol called HIGHLIGHT, which capitalized on OPIOM
and further improved its selectivity. In HIGHLIGHT, the RSFs are submitted to harmonic light modulation and their contribution to the overall fluorescence emission signals is selectively retrieved from exploiting their singular non-linear response under
optimized conditions. HIGHLIGHT has been implemented to image RSFPs in cells without interference of autofluorescence,
to perform multiplexed imaging of 3 RSFPs which could not be discriminated with OPIOM, and used for its intrinsic optical
sectioning. The RSF signature has been then used in a second fluorescence imaging protocol called LIGHTNING. In contrast to
OPIOM and HIGHLIGHT which exploit the cross sections of fluorescence photoswitching in a steady-state regime of low light
intensity, LIGHTNING exploits the transient time fluorescence response of RSFs under multiple illuminations involving various
ranges of light intensities for RSF discrimination. Thus, LIGHTNING allowed us to improve the multiplexing degree of dynamic
contrast in fluorescence imaging up to 20 RSFP among 22 studied RSFPs
Notre groupe de recherche avait déjà mis au point les protocoles OPIOM pour l’imagerie par fluorescence. En exploitant les sections efficaces de photoswiching de fluorescence, OPIOM permet d’extraire sélectivement la réponse des fluorophores réversiblement photoswitchables (RSFs) en présence de fluorophores interférant spectralement. Cependant, OPIOM nous a permis de ne
distinguer que 3 RSFPs spectralement similaires. L’objectif de cette thèse était d’augmenter ce nombre. Pour atteindre cet objectif, un nouvel instrument automatisé appelée photoswichomètre a été mis au point pour cribler la signature photochimique de 22
RSFP en analysant leur réponse de fluorescence aux sauts de lumière dont l’intensité couvre 5 ordres de grandeur. Cette signature
a d’abord été exploitée dans un nouveau protocole d’imagerie par fluorescence appelé HIGHLIGHT, qui a capitalisé sur OPIOM
et amélioré encore sa sélectivité. Dans HIGHLIGHT, les RSFs sont soumis à une modulation harmonique de la lumière et leur
contribution aux signaux d’émission de fluorescence globale est sélectivement récupérée en exploitant leur réponse non linéaire
singulière dans des conditions optimisées. HIGHLIGHLIGHT a été implémenté pour l’imagerie des RSFPs dans les cellules
sans interférence d’autofluorescence, pour réaliser l’imagerie multiplexée de 3 RSFPs qui ne pouvaient pas être discriminés avec
OPIOM, aussi pour améliorer l’effet de sectionnement optique. La signature des RSF a ensuite été utilisée dans un deuxième
protocole d’imagerie par fluorescence appelé LIGHTNING. Contrairement à OPIOM et HIGHLIGHT qui exploitent les sections
efficaces de la photoswitching en régime permanent de faible intensité lumineuse, LIGHTNING exploite le régime transitoire
des RSFs sous de multiples illuminations impliquant diverses gammes d’intensités lumineuses pour la discrimination RSF. Ainsi,
LIGHTNING nous a permis d’améliorer le degré de multiplexage du contraste dynamique en imagerie de fluorescence jusqu’à
20 RSFP sur 22 RSFP étudiés